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Observatoire National de la résistance du VHC aux antiviraux directs


L'étude de la résistance des virus d'hépatites aux antiviraux à action directe se fait en étroite collaboration avec l'ANRS à travers l'Observatoire National de la Résistance du VHC aux Antiviraux à Action Directe adossé à la cohorte nationale HEPATHER (ANRS CO22), ainsi que du groupe de virologie médicale de l'Action Coordonnée 33 (AC33), tous deux coordonnés par les Prs Jean-Michel Pawlotsky et Stéphane Chevaliez.

Observatoire National de la résistance

De nombreuses options thérapeutiques sont désormais disponibles pour le traitement des patients atteints d'hépatite chronique C. La France a bénéficié en 2014-2015 d'un accès compassionnel au sofosbuvir, simeprevir et au daclatasvir dans le cadre de l'ATU de cohorte. Désormais de nombreuses molécules (sofosbuvir, simeprevir, daclatasvir, ledipasvir-sofosbuvir, paritaprevir/ritonavir et ombitasvir avec ou sans dasabuvir, grazoprevir-elbasvir, sofosbuvir-velpatasvir) ont l'AMM. L'efficacité de ces antiviraux directs (AAD) est élevée, avec des taux de guérison, caractérisés par un ARN viral indétectable 12 semaines après l'arrêt du traitement, supérieurs à 90%. La majorité des échecs de traitement sont des rechutes, définies par un ARN viral à nouveau positif après l'arrêt du traitement chez des patients l'ayant négativé sous traitement. Ces rechutes surviennent majoritairement dans les premières semaines suivant l'arrêt du traitement. L'analyse des populations virales des patients en échec de traitement à l'aide de méthodes de séquençage direct ("population sequencing") ou de méthodes plus sensibles de séquençage de nouvelle génération (UDPS) montre que la majorité des patients abrite des virus résistants à un ou plusieurs des antiviraux directs administrés. Le rôle de la résistance dans la non-réponse au traitement est probablement important, mais reste à évaluer.

Les objectifs principaux de cet observatoire seront de mesurer l'incidence de la résistance du VHC aux antiviraux directs et de caractériser les profils de résistance des patients en échec de traitement inclus dans HEPATHER.

Les objectifs secondaires seront les suivants :

  • Etudier la persistance des variants viraux résistants au cours du temps après l'arrêt du traitement antiviral.
  • Caractériser la dynamique des populations virales résistantes aux antiviraux directs.
  • Développer des stratégies antivirales de retraitement des patients en échec de traitement.

A ce jour, près de 6000 patients ont initié un traitement incluant au moins un DAA depuis au moins 12 semaines et 358 (6,5%) patients sont en échec de traitement. Le séquençage direct des 3 régions ciblées par les antiviraux indique que la majorité des patients en échec abritent des variants résistant ayant une ou plusieurs substitutions amino acidiques conférant une diminution de sensibilité à un ou plusieurs DAA (résultats préliminaires).

Plateformes Phénotypiques

Plateforme HCV

Des modèles de réplicons subgénomiques ont été développés au CNR.

Le système réplicon est fondé sur une construction chimérique bicistronique organisée de la manière suivante : un domaine comprenant l'extrémité 5' non codante du VHC, incluant l'IRES, le gène de résistance à la néomycine et un gène rapporteur luciférase, puis un deuxième domaine comprenant l'IRES du virus EMCV (encephalomyocarditis virus) qui dirige la traduction des protéines non structurales du VHC ; la construction se termine avec l'extrémité 3' non codante du génome viral. Les réplicons sous-génomiques sont dépourvus des séquences codant les protéines structurales, p7 et NS2 qui ne sont pas nécessaires à leur réplication. Des substitutions amino acidiques candidates sont introduites par mutagénèse dirigée sur un (ou plusieurs) plasmide(s) et l'analyse phénotypique est réalisée sur des réplicons transitoires (réplicons de sous-type 1b ou 2a) ou des réplicons " stabilisés " (réplicons de génotype 3, 4 ou 5) dans des lignées d'hépatomes humains Huh-7.5. Après mutagénèse dirigée et linéarisation du (ou des) plasmide(s), celui-ci (ceux-ci) est (sont) transcrit(s) in vitro via une ARN polymérase T7. L'ARN du réplicon sous-génomique ainsi généré est transfecté dans des lignées d'hépatomes humains Huh-7.5. Après stabilisation (pour les génotypes 3, 4 ou 5), les tests phénotypiques sont effectués en présence de concentrations croissantes des antiviraux étudiés. L'inhibition de la réplication virale est évaluée par la mesure de l'activité luciférase en présence de différents antiviraux. Le niveau de résistance des différents mutants est mesuré par l'étude de la concentration efficace 50 (CE50) et la concentration efficace 90 (CE90), qui correspondent aux concentrations de l'antiviral permettant d'inhiber la réplication virale respectivement de 50% et de 90%.

Plateforme HBV

Une plate-forme phénotypique de caractérisation de la résistance du VHB aux analogues nucléos(t)idiques a été mise en place. Elle est composée d'un modèle cellulaire de réplication et d'infection du VHB permettant la caractérisation de la résistance conférée par les substitutions amino acidiques observées chez les malades, ainsi que l'étude de la capacité réplicative des variants résistants. Le modèle infectieux est fondé sur la transfection dans des cellules Huh7, une lignée d'hépatomes humains, d'un plasmide codant le génome du VHB (pCH-9/3091 de 3182pb) de génotype D de sous-type A sous contrôle d'un promoteur CMV (Nassal et al, 1992). La transfection est réalisée dans un laboratoire de type P3 ; 120 h plus tard, le surnageant est récupéré, filtré et digéré par une DNAse pour éliminer le plasmide résiduel. L'ADN du VHB est ensuite extrait et la réplication virale est mesurée par le biais d'une qPCR spécifique du VHB.

Les substitutions amino acidiques observées chez les malades sont insérées par mutagénèse dirigée et les plasmides sont transfectés selon la même technique. Les tests phénotypiques sont effectués en présence de concentrations croissantes des analogues nucléos(t)idiques. L'inhibition de la réplication virale est évaluée par la mesure par qPCR de la quantité d'ADN du VHB produite dans le surnageant cellulaire en présence de différents antiviraux. Le niveau de résistance des différents mutants est mesuré par l'étude de la concentration efficace 50 (CE50) et de la concentration efficace 90 (CE90), qui correspondent aux concentrations d'antiviral permettant d'inhiber la réplication virale respectivement de 50% et de 90%.