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Plateforme de caractérisation des génomes microbiens par séquençage à haut débit

Dr Christophe RODRIGUEZ, Responsable

"La métagénomique, au cœur du dépistage et de la caractérisation des pathogènes microbiens."

A l'origine...

La plateforme de séquençage à haut débit (next-generation sequencing, NGS) a été créée en 2012 à l'initiative de l'Institut de Recherche Biomédicale (IMRB), centre de recherche INSERM de la faculté de médecine de Créteil, et du Pôle de Biologie et de Pathologie du Groupe Hospitalier Henri Mondor (Assistance Publique-Hôpitaux de Paris), soutenue par un financement INTER-DIM (Région Ile-de-France) et des financements spécifiques de l'Université Paris-Est Créteil, de l'Assistance Publique-Hôpitaux de Paris et de l'Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS). Positionnée dès l'origine autour d'un axe microbiologique médical et de recherche, la plateforme occupe aujourd'hui une place importante dans le développement des techniques de NGS pour le diagnostic et la caractérisation des pathogènes microbiens.

Axes de développement

  • Développement d'approches diagnostiques permettant de détecter n'importe quel pathogène viral, bactérien ou fongique dans n'importe quel type de prélèvement à visée diagnostique ou de recherche.
  • Développement d'approches de caractérisation des pathogènes visant à les identifier, les classer et à mettre en évidence des mutations ou des gènes d'intérêt (par exemple résistance aux anti-infectieux).

Diagnostic des infections, identification de pathogènes à l'aveugle

L'émergence constante de nouvelles infections, favorisées par la globalisation, les voyages, le réchauffement climatique, posent la question du diagnostic des infections devant des symptômes peu spécifiques, dans des contextes peu évocateurs, sans pré-connaissance du germe recherché. Le développement de tests diagnostiques spécifiques des infections recherchées est par ailleurs coûteux, long à mettre en œuvre et souvent disponible trop tardivement. Le laboratoire s'est spécialisé dans le développement et l'application d'un test diagnostique d'infection " universel ", fondé sur une approche métagénomique. La métagénomique consiste à établir le répertoire de l'ensemble des espèces en présence dans un échantillon donné. Une première application a été la métagénomique ciblée (16S ou ITS) pour les bactéries ou les champignons, qui ne permettait cependant pas la recherche de virus à ADN ou ARN.

Notre laboratoire a développé un process complet de " shotgun metagenomic " permettant :

  • une extraction exhaustive de tous les pathogènes présents dans l'échantillon
  • une préparation simultanée et automatisée des banques d'ADN et d'ARN
  • un séquençage massif (plus de 80 millions de séquences par échantillon)
  • une analyse adaptée (figure ci-dessous) permettant l'identification de tous les microorganismes présents dans l'échantillon


La technique " shotgun metagenomic " a été validée sur des échantillons mono- ou polymicrobiens contenant des pathogènes bactériens, fongiques et/ou viraux. La figure ci-dessous montre la capacité à identifier les séquences de génomes entiers de différents virus provenant d'échantillons humains, incluant le VIH, le virus de l'hépatite C (VHC), le pegivirus humain de type 1 (HPgV), le virus zika (ZIKV), ou le virus respiratoire syncitial (VRS), ou de culture cellulaire (coronavirus humain 229E, HCoV). Pour chaque région du génome viral, la profonduer indique le nombre de séquences générées, permettant l'identification du pathogène par comparaison avec les banques de séquences.


Caractérisation des pathogènes

L'identification précise du ou des pathogènes ainsi que la mise en évidence de certaines de leurs caractéristiques génomiques ayant une incidence fonctionnelle est un autre atout de la technique de " shotgun metagenomic " développée sur la plateforme. Le séquençage en une seule expérimentation du génome complet de chaque pathogène présent permet d'obtenir l'ensemble des données génétiques, éventuellement à un niveau de variant minoritaires. Par exemple, la technique permet le génotypage et le sous-typage, ou la détection de variants viraux résistants dans des échantillons d'intérêts provenant du CNR des Hépatites Virales B, C et Delta.


Dans le cadre de ses missions de veille technologique, la plateforme teste également régulièrement de nouveaux équipements et/ou kits de NGS, en particulier dans le domaine du diagnostic et du typage.

Interactions hôtes-pathogènes

Les techniques de NGS permettent, dans le cadre de projets de recherche, de caractériser les modifications observées chez l'hôte dans différentes situations d'infection, avec ou sans traitement anti-infectieux. Les méthodes développées comprennent le RNA-Seq, le micro-RNA Sequencing et la transcriptomique. En lien avec le groupe travaillant sur le développement de nouvelles approches antivirales à large spectre, ces outils apportent de précieux renseignements pour l'identification des cibles antivirales et la compréhension des mécanismes d'action des antiviraux.

Ressources humaines

  • Bruno COSTES, Ingénieur de recherche (Responsable adjoint)
  • Vanessa DEMONTANT, Technicienne de laboratoire
  • Guillaume GRICOURT, Bio-informaticien
  • Corinne MARIE, Cadre médico-technique
  • Natacha MARTIN, Assistante ingénieur
  • Mélanie MERCIER-DARTY, Ingénieur hospitalier
  • Christophe RODRIGUEZ, MCU-PH (Responsable)

Collaborations

  • Jean-Winoc DECOUSSER, MCU-PH, Génome bactérien
  • Paul-Louis WOERTHER, MCU-PH, Microbiote

Réseaux

  • Plateforme soutenue par l'ANRS pour la réalisation de projets financés par cet organisme 
  • Animation du groupe NGS ANRS (C. Rodriguez, AG. Marcelin)
  • Création en cours d'un réseau NGS APHP pour le diagnostic

Formations

  • Formation pratique d'équipes sur la partie expérimentale ou analytique dans le domaine de la microbiologie
  • Animation d'un séminaire annuel " NGS en microbiologie"
  • Encadrement de Masters 2 "Microbiologie" (Paris 11 et Paris 6 IMVI)
  • Encadrement de Thèses (DES microbiologie, thèses d'université)

Services

Expérimentaux

  • Extraction ADN, ARN, tous types d'échantillons
  • Analyse qualitative et quantitative des acides nucléiques extraits
  • Préparation de banques (Amplicons, Nextera XT, Total RNA, mRNA, micro-RNA)
  • Séquençage adapté en fonction des besoins (MiSeq-NextSeq)

Analytiques

  • Dépistage des pathogènes bactériens, fongique ou viraux par utilisation d'un pipeline d'analyse développé sur le site par l'équipe
  • Cartographie génomique de SNP (single nucleotide polymorphism) de pathogènes (non accessible pour tous les pathogènes, se renseigner)
  • Développement de pipelines d'analyse sur mesure

Équipements

Expérimentaux

  • Extracteur automatisé : QiaSymphony
  • Automate de qualification des acides nucléiques : Tape Station 2000
  • Automates de préparation de banques : 2 Hamilton StarLet (1 pré-PCR, 1 post-PCR)
  • qPCR : 1 Light cycler 480, 1 ABI 7900, 1 RotorGene
  • Séquenceurs Sanger : 3 ABI 3130
  • Séquenceurs Illumina : 2 NextSeq 500 et 1 MiSeq
  • Séquenceurs IonTorrent : 2 PGM, 1 S5

Analytiques

  • Serveurs : 4 nœuds (25 Co, 1 To RAM/noeud) 
  • Stations de travail : 4 ordinateurs MultiCore, RAM (>24Go)

Software copyrights

  • Pyromute© (2010) (NGS data filtering and variant calling)
  • Pyrotree© (2010) (NGS data 3D phylogeny)
  • Pyrodyn© (2010) (NGS data viral evolution modeling)
  • Pyroclass© (2010) (NGS data demultiplexing)
  • Pyrotrop© (2011) (HIV-1 coreceptor usage prediction)
  • PyroMIC© (2013) (metagenomics analysis)